Costruita nel 1498 sui resti di un tempio precedente, la chiesa di Santo Spirito si presenta come un edificio dalle linee semplici, a capanna. Il bel portale in pietra risale al 1519 ed è attribuito a Baldassarre Peruzzi, mentre l'impianto della chiesa è opera di Francesco di Giorgio Martini. La cupola - eretta fra il 1504 e 1508, forse su disegno del Cozzarelli - fu costruita a spese del signore di Siena, Pandolfo Petrucci.
L'interno, restaurato nel 1921, contiene preziose opere d’arte: tre affreschi del Sodoma, San Sebastiano, Sant'Antonio abate e San Giacomo di Compostela; una pala del Sodoma, con San Nicola da Tolentino e San Michele arcangelo; un bel presepio in terracotta colorata del 1504, cui partecipò Ambrogio della Robbia; un San Vincenzo Ferreri, statua lignea del Cozzarelli; l'Incoronazione di Maria del Beccafumi; un San Giacinto di Francesco Vanni; le Storie di San Giacinto di Ventura Salimbeni; la Pentecoste, affresco di Giuseppe Nasini; l'Incoronazione di Maria, di Girolamo del Pacchia; un Crocefisso ligneo, opera di Sano di Pietro; una tavola della Madonna col Bambino, di Andrea Vanni. La statua lignea di Santa Caterina nella seconda cappella è del Cozzarelli; l’Assunta con San Francesco e Santa Caterina della prima cappella è attribuita a Matteo Balducci (1509).
