Il museo ha sede nei locali anticamente ricavati dalla chiusura di tre campate della navata destra del Duomo Nuovo, opera grandiosa rimasta incompiuta a causa della terribile pestilenza del 1348. Il Museo contiene opere scultoree, pittoriche e frammenti architettonici provenienti dalla facciata e dagli interni del vicino Duomo, nonché da Battistero e dagli oratori di S. Giovannino, di S. Gennaro e di S. Giovanni Battista della Morte.
Fra le opere più importanti si ricordano: un tondo di Donatello; dieci statue di Giovanni Pisano; un altorilievo di Jacopo della Quercia; la Maestà di Duccio Buoninsegna (1311), che un tempo ornava l'altare maggiore del Duomo. La tavola, dalle dimensioni di 2,11 x 4,26 metri, raffigura la Madonna in trono tra i Santi disposti in file parallele e simmetriche. Fondamentale nella creazione delle distanze tra una figura e l'altra, in una visione che fu definita polifonica, è l'uso del colore. Quest'opera è considerata fondamentale nello sviluppo dell'arte europea del primo Trecento: si percepisce subito che l’artista si stacca dalla fredda convenzionalità degli schemi bizantini, per infondere luce e colore nello spazio pittorico, che si carica di calore e di profondità espressiva. Altre opere di rilievo sono: il trittico con la Natività delle Vergini, del 1342, di Pietro Lorenzetti e il Beato Agostino Novello con quattro dei suoi Miracoli, opera del 1330 di Simone Martini. Infine la Madonna dagli Occhi Grossi, la tavola duecentesca dipinta a rilievo, davanti alla quale venne consacrata la città prima della battaglia di Montaperti.
Dal museo si può accedere alla sommità della facciata del Duomo Nuovo - il cosiddetto Facciatone - da cui si domina tutta la città e le colline circostanti.
