La Basilica benedettina di Santa Giustina domina il Prato della Valle e risale al Cinquecento, ma è stata preceduta da tre chiese: una prima chiesa, paleocristiana, detta Sacello di San Prosdocimo, fu eretta nel V secolo in area cimiteriale, sulla tomba della Martire padovana; una seconda, edificata in onore di Santa Giustina, che fu distrutta dal terremoto del 1117; una terza, tardo-gotica, abbattuta nel Cinquecento, per dar luogo all’attuale. Santa Giustina è quindi la prima chiesa di Padova. Il complesso monumentale comprende la Basilica, una delle più grandi della cristianità, ed il Monastero.
Iniziata nel 1498 dall’architetto Andrea Moroni, e portata a termine da Andrea della Valle, la Basilica cinquecentesca presenta un alto campanile ed otto cupole che ricordano l'architettura orientale. La facciata è rimasta incompiuta e l’esterno è a mattoni a vista. Sulla gradinata, stanno due grifi in marmo rosso di Verona, che fanno parte del bel portale duecentesco.
L'interno, ampio e ben illuminato, è a croce latina e presenta tre navate, divise da grandi pilastri. Le navate laterali sono scandite dalle cappelle, impreziosite da pale d’altare di artisti del Seicento, fra i quali Luca Giordano e Palma il Giovane. Sulla navata di destra, dietro l’Arca di San Mattia, si trova il cinquecentesco Pozzo dei Martiri, che raccoglie le reliquie dei martiri padovani. Poco oltre si trova il Sacello di San Prosdocimo, residuo del complesso primitivo, riccamente decorato con marmi e mosaici.
Assai interessanti sono ancora; la Cappella di San Massimo, con il gruppo marmoreo della Pietà, opera di Filippo Parodi; la trecentesca Cappella di San Luca, che contiene la tomba di Elena Lucrezia Cornaro Piscopia, la prima donna laureata nella storia; l'architrave del portale romanico della basilica distrutta nel 1117; l’Arca di San Luca, opera pisana del primo Trecento, decorata con stupendi rilievi in alabastro; gli arredi lignei seicenteschi della sagrestia; gli affreschi di Sebastiano Ricci, nella cappella a sinistra del presbiterio. Prezioso il cinquecentesco coro in noce, intagliato e scolpito da Ricardo Taurigny: la parete di fondo ospita la pala del Martirio di Santa Giustina, uno dei capolavori di Paolo Caliari, detto il “Veronese” (1575 circa).
Il Monastero è importante perché qui - nel Quattrocento - l'Abate Ludovico Barbo iniziò la grande riforma benedettina detta della Congregazione di Santa Giustina. Soppresso dai decreti napoleonici del 1810, fu trasformato in caserma e ospedale militare. Tornò ai benedettini nel 1919 ed eretto nuovamente in Abbazia nel 1943. Splendidi sono il Chiostro del Capitolo, che risale al XII secolo, e il Chiostro Maggiore, detto anche Chiostro Dipinto, perché un tempo era decorato con vari affreschi. Notevole la Biblioteca monastica medioevale e, soprattutto, il rinomato Laboratorio per il Restauro del Libro.